中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所近日在《Horticulture Research》發(fā)表了文獻(xiàn)為《Targeted creation of new mtants with compact plant architecture using CRISPR/Cas9 genome editing by an optimized genetic transformation procedure in cucurbit plants》。本文獻(xiàn)中采用了LUYOR-3415RG熒光蛋白激發(fā)光源來篩選GFP陽性的植株。

文獻(xiàn)摘要

葫蘆科的水果和蔬菜，如黃瓜、甜瓜、西瓜和南瓜，對(duì)人類飲食有很大貢獻(xiàn)?；蚪M編輯技術(shù)的廣泛使用極大地加速了基因功能表征和作物改良。然而，大多數(shù)經(jīng)濟(jì)上重要的葫蘆科植物，包括甜瓜和南瓜，仍然對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化具有抗拒性，從而限制了基因組編輯技術(shù)的有效使用。在本研究中，我們采用“佳滲透強(qiáng)度"策略建立了的甜瓜和南瓜遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。我們利用這種方法的力量來靶向ERECTA的同源物受體激酶基因家族，并創(chuàng)造了等位基因，導(dǎo)致甜瓜、南瓜和黃瓜中節(jié)間較短的緊湊植物結(jié)構(gòu)。此處介紹的優(yōu)化轉(zhuǎn)化方法能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的誘變，并為葫蘆科作物的功能基因操作提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

葫蘆科長期以來被認(rèn)為是難轉(zhuǎn)化的作物之一，嚴(yán)重阻礙了基因組編輯工具的應(yīng)用。在黃瓜和西瓜中已經(jīng)報(bào)道了成功的遺傳轉(zhuǎn)化和基因組編輯[ 13 , 14 ]。然而，黃瓜的轉(zhuǎn)化效率仍然很低，用于西瓜再生的間接器官發(fā)生目前與其他葫蘆科作物不兼容。因此，其他經(jīng)濟(jì)上重要的葫蘆科作物，如甜瓜和南瓜，仍然難以穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，這極大地阻礙了功能基因組研究和快速產(chǎn)生賦予這些作物理想性狀的突變。

農(nóng)桿菌浸潤被認(rèn)為是建立穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的關(guān)鍵。在器官發(fā)生過程中，不定芽從不同植物物種的原形成層或形成層細(xì)胞開始 [ 25 ]，這些組成了農(nóng)桿菌感染的靶組織。然而，盡管以前的研究認(rèn)識(shí)到需要感染外植體的更深細(xì)胞層，但尚未開發(fā)出統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。在實(shí)踐中，必須在感受態(tài)細(xì)胞的充分感染和整個(gè)外植體的過度感染之間取得良好的平衡，這會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的損傷并降低轉(zhuǎn)化效率。

為了克服這些問題，我們采用了佳強(qiáng)度的浸潤策略來確定特定的一組條件，以確保血管組織中的形成層細(xì)胞*感染，同時(shí)對(duì)外植體造成盡可能小的損傷。在這里，我們確定了真空滲透、超聲處理和微刷的佳強(qiáng)度，以獲得良好的甜瓜和南瓜轉(zhuǎn)化效率，我們還在培養(yǎng)基中添加了抗氧化劑 LA，以保護(hù)外植體免受損傷。在這些優(yōu)化的條件下，維管組織感染有效，外植體損傷小，導(dǎo)致甜瓜和南瓜的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，效率約為4%。使用相同的策略，我們提高了不同黃瓜種質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率，并部分克服了基因型依賴性。

這種在葫蘆科作物中且穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)使我們能夠在這些物種中進(jìn)行 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯。擬南芥ER基因家族編碼富含亮氨酸的重復(fù)受體樣激酶，已被證明可調(diào)節(jié)莖伸長 [ 27 ]。編輯瓜類ER同源物在甜瓜、南瓜和黃瓜中產(chǎn)生了er突變體。所有突變體都具有較短的節(jié)間和矮化表型，這可能有利于改善植物結(jié)構(gòu)和育種。

總之，我們提出了一種穩(wěn)定的甜瓜和南瓜遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，并證明 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組編輯在這些葫蘆科作物中是有效的。這里描述的方法將大大加快對(duì)葫蘆科作物的研究，包括基礎(chǔ)植物生物學(xué)和優(yōu)良品系的創(chuàng)造。

植物材料和生長條件

本研究分析了十個(gè)甜瓜品種：P147（栽培甜瓜）、ivf105（栽培甜瓜） 、m1（栽培甜瓜）、m2（栽培甜瓜）、m3（栽培甜瓜）、m4（栽培甜瓜）、m5（野生甜瓜） , m6 (栽培甜瓜), m7 (栽培葡萄) 和景玉（商業(yè)雜交種），其中 ivf105 和 m1 到 m7 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所（IVF）王懷松提供。本研究使用黃瓜自交系Cu2（華南型）、新太米刺（華北型）、404（華北型）和Eu1（歐洲型）的種子。兩種商業(yè)moschata材料，金心針4號(hào)和金心針11號(hào)，用于南瓜改造。在分化和生根階段將所有組織培養(yǎng)物保持在培養(yǎng)室中。生根后，將再生植物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中約一周，然后在溫室中種植，光照條件為 16 小時(shí)光照/8 小時(shí)黑暗，溫度范圍為 18°C 至 24°C。

需要使種子發(fā)芽以獲得外植體，種子發(fā)芽的條件如下。將種子在 50°C 的溫蒸餾水中浸泡 30 分鐘，然后用鑷子去除種皮。種子用 75% 乙醇 15 秒和 1% 次氯酸鈉溶液 15 分鐘進(jìn)行表面消毒，然后用無菌蒸餾水沖洗 6 次。瓜子、南瓜和黃瓜的滅菌種子在 28°C 下在含有 7.5 mL 滅菌水的培養(yǎng)皿上涂抹 1-2 天。在 28°C 下，僅將 Cu2 種子散布在含有 GM 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上。

sgRNA設(shè)計(jì)和質(zhì)粒構(gòu)建

sgRNA 是使用 CRISPR-GE 網(wǎng)絡(luò)工具 設(shè)計(jì)的。如前所述 [ 49 ] 將 sgRNA 插入 pBSE402 載體。簡而言之，將含有 1.5 μL 100 μM 正向引物、1.5 μL 100 μM 反向引物、5 μL 10× NEB 緩沖液 3.1 和 42 μL 水的 50 μL 混合物在 95°C 下孵育 5 分鐘，然后升溫以 0.1°C/s 下降到 20°C，產(chǎn)生一個(gè)短的雙鏈 DNA 片段。使用限制酶Bsa I 和 T4 連接酶 (New England Biolabs)將短 DNA 片段插入 pBSE402 。將構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105。引物顯示在表 S2。

檢測(cè) GFP 熒光

為了篩選 GFP 陽性植物，在組織培養(yǎng)階段使用 Leica MZ10 F 立體顯微鏡（Leica Microsystems，Germany）檢查再生一個(gè)月的外植體。在溫室中用LUYOR-3415RG激發(fā)光源（Luyor Instrument，上海）激發(fā)后觀察植物的綠色熒光蛋白GFP熒光。將不同感染強(qiáng)度處理的外植體在冰上沿橫向和縱向手工切片，在立體顯微鏡下立即觀察到有血管組織部分的GFP熒光。

上圖為：（a，b和c）GFP強(qiáng)度，感染維管組織的外植體，以及五種不同處理下甜瓜m1的存活率，分別。數(shù)據(jù)是三個(gè)重復(fù)的平均值，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。不同的小寫字母表示差異顯著（p<0.05，Tukey 檢驗(yàn)）。(d) 將再生的轉(zhuǎn)基因 T0 甜瓜植物轉(zhuǎn)移到土壤中。轉(zhuǎn)基因甜瓜 T0 植物的 GFP 熒光頂端分生組織 (e) 和種子 (f 和 g)。LUYOR-3415RG 的 GFP 通道下甜瓜的轉(zhuǎn)基因 T1 植物 (h) 和 WT (i)。組織因 GFP 表達(dá)而呈綠色，因葉綠素自發(fā)熒光而呈紅色。

注：內(nèi)容為谷歌翻譯，并非原作者翻譯